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跟進：干細胞干預缺血性腦卒中的臨床試驗取得新進展

添加時間：2021-04-28 15:08 瀏覽：59

近年來，干細胞干預被認為是一種很有前景的缺血性腦卒中治療策略，能有效地促進該類患者的康復。因此，各種細胞，包括骨髓單個核細胞(BMMNCs)、骨髓/脂肪源性間充質細胞(BMSCs/ADMSCs)、臍帶血細胞(UCBCs)和造血干細胞、神經干細胞(NSCs)、嗅鞘細胞(OECs)等都已被探索。動物研究表明，這些細胞可能改善腦卒中后的神經功能缺損，有些已經在臨床試驗中得到了一些有利的結果。然而，許多問題，如最佳細胞類型、細胞劑量、移植途徑和候選患者類型等仍未解決。

圖1. 干細胞干預缺血性腦卒中尚未解決的問題。最有效、最安全的干細胞干預方法尚未建立。挑戰包括細胞、細胞劑量、移植途徑和患者類型的選擇

臨床試驗的關鍵方面

在clincaltrials.gov共檢索到43項已發表的臨床試驗(表1)。試驗分為急性(卒中發作后1周內干預)、亞急性(卒中發作后1周至6個月干預)和慢性(卒中發作后6個月干預)。不同試驗以及試驗所在國家的方法差異很大。自體骨髓基質細胞占細胞的最大比例，其次是自體骨髓干細胞/基質細胞。細胞劑量差異很大，在1×106 ~ 1×109之間，而移植途徑包括靜脈(IV)、動脈(IA)、鞘內或腦室內(IT)和腦內(IC)途徑。血管內途徑(IV和IA)比腦內途徑(IC)提供更高的細胞數量 (109 VS 106-7)。這是因為IC移植需要限制細胞的數量以避免產生占位效應。靜脈移植似乎更適合急性期至亞急性期，而腦內移植或IT移植大多在慢性期進行。這些試驗大多是初級階段，沒有設立對照組，而有些試驗確實設立了由非盲或盲法患者組成的對照組。除一項研究外，其他研究均未報道細胞干預對人體產生不利影響。雖然不同試驗的評估方式也有很大差異，但常用的是修正Rankin量表(mRS)、國立衛生研究院卒中量表(NIHSS)和Barthel指數。

急性期

將中風發作后一周內的細胞移植定義為急性期的干預。由于自體間充質干細胞在體外條件下很難在這段時間內擴增，因此選擇了BMMNCs或異體細胞。這些試驗使用靜脈或動脈移植，沒有使用腦內注射。在這段時間內，自體恢復強烈影響最終結果，因此在評估結果時應予以考慮。雖然沒有建立對照組的小型早期研究報告了良好的臨床恢復，兩項設立對照組患者的靜脈和動脈移植的研究報告了功能恢復和對照組之間沒有統計差異。然而，根據分析，一項研究宣稱那些在24-36小時(試驗納入24 - 48小時)接受細胞干預，一年后運動恢復有顯著改善。這表明早期接受骨髓間充質干細胞靜脈注射的患者從干預中獲益。目前，在新的時間點(24-36小時)條件下使用這些細胞的研究正在日本進行。

亞急性期

一周到6個月被認為是亞急性干預。除了BMMNCs外，自體骨髓間充質干細胞也可在大約1個月的時間內進行體外擴增。IV或IA移植在臨床試驗中占多數，而IT移植也有報道。這些研究的結果大多與小樣本試驗急性期報告的良好結果相似，而較大的隨機試驗顯示異質療效。Prasad等人進行了一項大型試驗，包括118名患者，其中一半患者在損傷后7到10天接受了大約3×107自體BMMNCs。這項II期多中心、平行組、隨機盲法試驗顯示，雖然靜脈輸注BMMNCs是安全的，但它對卒中結局沒有任何有益的影響。Lee等人報道，與隨機對照相比，靜脈注射1×108個BMSCs可在治療開始后5年內獲得更好的恢復并降低死亡率，而Jaillard等人并未報道整體受益。IA干預的結果在不同的試驗中也不同。Bhatia報道了通過IA移植自體BMMNCs良好的恢復趨勢(P = 0.06)，而其他研究沒有報道這種差異。

慢性期

缺血性卒中6個月后開始干預被認為是慢性期干預。目前尚無針對這一階段的有效干預方法，因此建立有效的干預流程備受期待。有趣的是，在這段時間內，IC或IT注射占據了大多數移植途徑。然而，只有一項研究采用了對照組患者進行IC移植，本研究報道了CD34陽性造血細胞的IC移植與對照組相比，存在明顯的神經恢復。雖然篩查的患者數量很少(N = 6個)，但與對照組相比，它注射的恢復效果更好。靜脈移植的結果在不同的試驗中有所不同，一些研究報告與對照組相比有顯著的恢復，而另一些則沒有。使用大量患者樣本的隨機臨床試驗目前正在進行中(NCT02448641, NCT02448641)，有望很快得到結果。

表1. 已發表的利用干細胞干預缺血性卒中的臨床試驗

與最佳干預相關的未解決問題

如前所述，許多干細胞類型，包括單核細胞(MNCs)、MSCs、OECs和NSCs已被作為有希望的細胞來源進行了深入研究，并通過臨床試驗進行了測試。一些細胞利用基因修飾來增強營養因子的釋放和自身的生存。自體細胞(MSCs、MSCs、OECs)具有移植后排斥反應和過敏風險低的優勢，而異體細胞(MSCs、NSCs)則具有易于大規模生產和標準化庫存的優勢。這里討論的臨床試驗顯示了從自體細胞到異基因細胞的趨勢，其目標是大規模制造用于商業目的。在將可用的細胞來源進行商業用途之前，必須考慮幾個因素，如安全性、效率、成本和大規模生產的可行性。最近的報道表明，如果使用不同的設備和方法產生，來自同一骨髓的MSCs可能表達不同的功能和分子表型。這表明，在細胞制備過程中，保持一致的質量是困難的。每種干細胞類型都有各自的優點和缺點，目前還不清楚哪種細胞類型是最有效的。

細胞劑量及途徑

靜脈移植的優點是侵襲性最低，允許多次注射。這種方法也不需要移植的特殊設備。然而，盡管有療效，在受損的病灶中經常發現少量的細胞，然而大多數細胞被困在肺部。神經營養因子對細胞凋亡和炎癥的改善作用被認為是靜脈移植的主要干預機制。這在缺血性中風的急性期是有用的，但在細胞損傷和炎癥大多得到解決的慢性期可能就沒有益處了。在向病灶輸送更多細胞方面，IA方法被認為優于靜脈注射。然而，最近的報道表明，這種方法對腦內并不有效。這種方法的一個缺點是，細胞簇阻塞動脈會造成額外的缺血性損傷。IT應用可以將大量細胞送入蛛網膜下腔，相對于IC移植侵襲性較小。然而，細胞移植的比率尚不清楚，并可能出現腦積水和積液等并發癥。腦實質直接注射的方法達到了最高水平的細胞植入，但需要侵入性手術，而且注射針造成額外腦損傷的風險不應被低估。

如前所述，在急性期和亞急性期，首選IV和IA移植，使用大量細胞，最多可達109個細胞，而在慢性期，首選較少細胞劑量107個細胞的IC移植。有趣的是，大多數IV/IA移植的干細胞并不存在于大腦中，而是存在于其他器官中，如肺、脾和膀胱。Rosado-de-Castro等人將锝99m標記的BMMNCs靜脈和動脈內移植到亞急性腦卒中患者，發現在移植后2-24小時，只有0.6% - 0.9%的細胞存在于大腦中。他們報告說，IA移植組有更高的放射性計數在肝臟(2h: 40%和24小時:47%)和脾臟(2 h: 6%和24小時:7%)，肺部較少(2 h: 24 h: 7%和4%)。而靜脈移植(肝臟14%和19%，脾臟2%和3%，和肺21%和7%)。根據這一結果，移植后不久靜脈移植細胞和動脈內移植細胞的分布不同，隨后靜脈移植細胞分布在肺內，而動脈內移植細胞分布在肝臟內。這一結果與其他關于動脈內移植锝99m標記的BMMNCs的報道相似，后者在缺血2小時后出現在腦內，主要攝取發生在肝臟、肺、脾臟、腎臟和膀胱。24h后，腦內細胞幾乎不可見，其他器官仍可見攝取。這些結果表明，靜脈或動脈內移植的細胞不能在大腦中停留很長時間。

圖2. 臨床試驗中細胞類型、劑量和患者特征之間的關系。需要注意的是，急性期首選靜脈移植，而慢性期首選腦內移植。

未來方向

大多數臨床試驗，特別是使用自體細胞的試驗，完全是在一家醫院內進行的，細胞制備也在現場進行。一些臨床試驗提到了GMP級細胞生產，而另一些沒有。GMP是一種保證質量控制的藥品生產，將風險降至最低的體系。它涵蓋了生產的各個方面，如物料的處理和檢查、按照標準操作程序(SOP)生產藥品、適當的藥品包裝、配送管理等。遵循GMP既費時又費錢，然而，在許多國家，除非遵循GMP，否則這些細胞將不符合藥物使用的條件。問題是每個國家都有自己的GMP要求。制藥企業必須符合藥品生產所在國的要求。許多監管機構正在共同努力制定一套藥品審批的通用規則，這一政策有助于在未來實現更快的藥品開發和審批。

許多臨床試驗是以研究人員為主導的試驗，政府或公共資金用于細胞生產。細胞制備可能非常昂貴，為了使干細胞成為標準的治療方法，需要將成本降至最低。目前的細胞擴增方案需要經驗豐富的技術人員的專業知識。同種異體干細胞適合使用自動化細胞生產機器批量生產，然而，當涉及到自體干細胞時，就需要創新技術，因為自體干細胞是定制的，很難用于自動化生產。細胞物流是另一個關鍵問題。干細胞不同于普通的低分子藥物化合物，其功效依賴于活性，這意味著足夠的活細胞是必須的。臨床試驗中經常采用干細胞的超低溫保存和運輸，但超低溫保存的試劑含有DMSO，一種可能有毒的試劑，在極低溫下運輸(使用液氮)費用昂貴。因此，以可承受的成本生產和轉移干細胞需要進一步優化。